JCI|最新双特异性CAR-T方案,可克服神经母细胞瘤抗原表达异质性

  • 2022-09-16 10:00:07    腾讯健康
  • 陈更
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撰文 | 苗馨芳 责编 | 周叶斌

神经母细胞瘤 (neuroblastoma,NB) 是儿童期最常见的颅外实体癌,其常见的肿瘤基因组变异是MYCN 基因扩增(MYCN-A)。与 MYCN 未扩增 (MYCN-NA) 比,MYCN扩增(MYCN-A)型肿瘤的患者总生存期更短,转移风险更高。可靶向 MYCN 或其他 NB 核心调控转录因子仍然是一大挑战,基因组研究仅在不到 10% 的神经母细胞瘤中发现了可成药的体细胞突变。近期,抗 GD2 单克隆抗体与GM-CSF和异维甲酸联用的免疫治疗显示出疗效,成为高危 NB 的治疗标准。尽管抗 GD2 免疫疗法为患者带来了预后改善,但神经母细胞瘤患者总体存活率仍然很低。因此,需要额外的疗法来治疗这种高度侵袭性的癌症。

CAR-T细胞疗法可有效治疗难治性和复发性B细胞白血病和淋巴瘤,其中6种靶向CD19或BCMA的CAR-T治疗获得FDA批准。然而,由于肿瘤相关抗原 (TAA) 的异质表达,不利的肿瘤微环境等原因,这些积极的疗效并未在实体瘤中重现。

迄今为止,六种NB-TAA正在作为CAR-T疗法的靶点被开发,包括GD2,L1-CAM (CD171) ,Glypican-2 (GPC2),CD276 (B7-H3) ,ALK和NCAM。只有针对GD2、L1-CAM和CD276的CAR-T疗法进入临床试验。尽管这些疗法在4项临床试验中显示出安全性,但它们的疗效和T细胞持久性有限,很少有患者达到完全或部分缓解。除了GD2和L1-CAM,最近的研究表明 GPC2和CD276有希望成为免疫治疗的细胞表面靶标。GPC2和CD276在包括NB在内的多种儿科癌症中均显著过表达,而在正常组织中表达低或检测不到。GPC2对发育中的神经系统中神经元的生长和分化至关重要。而CD276是一种参与肿瘤免疫逃避和转移的检查分子。在肿瘤血管中也观察到CD276的表达增强,其过度表达与许多癌症的不良预后相关。此外,上述针对CD276的CAR-T细胞临床试验目前正在包括NB在内的实体瘤中进行。这些特征及其在细胞表面的位置使它们成为NB的有希望的免疫治疗靶点。尽管在临床前研究中有关于靶向GPC2或CD276有效的报道,但尚未确定CAR-T的效果。

2022年8月15日,Javed Khan团队在The Journal of Clinical Investigation上发表了题为An optimized bicistronic chimeric antigen receptor against GPC2 or CD276 overcomes heterogeneous expression in neuroblastoma的文章。该研究使用BiCisCAR靶向多种TAA可以克服实体瘤中靶抗原的异质表达,并确定了一种有效的、临床相关的针对NB的CAR。

首先,GPC2和CD276在NB肿瘤和细胞系中异质表达。GPC2和CD276被认为是NB免疫治疗的两个有希望的靶标。然而,TAA的异质表达是一种常见现象,会导致肿瘤免疫逃逸,从而限制 CAR-T 细胞治疗实体瘤的疗效。在对194个NB肿瘤和40个NB细胞系进行测序后,研究人员证实GPC2和CD276与正常组织中的表达水平相比高表达,但在样本之间显示出显著的异质性。此外,GPC2和CD276表达水平与肿瘤的MYCN扩增状态无关。GPC2和CD276的联合表达分析显示,在大约95%的NB样本中高表达。

GPC2和CD276在NB肿瘤和细胞系上高度和异质性表达

其次,P-COCC揭示了个体CAR-T细胞活性特征。P-COCC是一种汇集了多模式单细胞分析方法,通过对CAR构建体的结合域进行测序来同时鉴定CAR-T细胞,并使用28种蛋白质标记物通过CITE-Seq确定T细胞功能。为了评估哪些CAR-T细胞具有最高活性,研究人员接下来测量了所有14种CAR-T细胞类型的CD8+效应T细胞的变化。在8种抗GPC2 CAR中,CT3 CAR-T细胞中簇11的频率增加最多,从17%增加到44%。与其他7种抗GPC2 CAR-T细胞相比,受刺激的CT3 CAR-T细胞显着上调了参与抗肿瘤活性和增殖能力的基因的表达。同时研究人员检测了抗CD276 CAR-T细胞之间的差异。在6种抗CD276 CAR中,与其他5种构建体相比,MGB7H3-LH CAR表现出更高的趋化因子基因表达。总体而言,使用P-COCC的方法揭示了CT3和MGB7H3-LH作为CAR-T细胞,分别具有激活的效应T细胞特征以及抗GPC2和CD276 CAR的多功能性。

P-COCC确定了具有更高激活和抗肿瘤多功能特征的最佳抗GPC2 CAR CT3

此外,细胞毒性试验证实CT3和MGB7H3-LH分别是靶向GPC2和CD276的最有效的CAR构建体。CT3 CAR-T细胞以1:1的效应/靶 (E/T) 比率介导了对表达高水平GPC2的非MYCN扩增细胞的最有效杀伤,并产生很多抗肿瘤效应的细胞因子。对于抗CD276 CAR,所有6种候选CAR-T细胞均显示出对NB细胞的高度特异性杀伤活性。其中,MGB7H3-LH CAR-T细胞对NB细胞的杀伤活性最高。因此, P-COCC分析与细胞毒性和细胞因子分析一致,证明了CT3 CAR是最有效的抗GPC2 CAR,以及MGB7H3-LH是最有效的抗CD276 CAR构建体。

14 种CAR的细胞毒性测定证实CT3是最有效的靶向GPC2的CAR,MGB7H3-LH是最有效的靶向 CD276的CAR

BiCisCAR-T细胞在体外杀死共表达GPC2和CD276的NB细胞方面表现出强大的活性,且GPC2/CD276 BiCisCAR对表达GPC2或CD276的肿瘤细胞表现出优异的抗肿瘤活性。BiCisCAR可切割T2A序列连接的2个完整CAR结构,并为两者使用4-1BB共刺激结构域结合剂,允许两种构建体在同一个T细胞中共表达。体外细胞溶解试验表明,这种BiCisCAR具有与高密度GPC2和CD276和中等水平抗原密度的NB细胞相当的杀伤能力。

靶向GPC2和CD276的BiCisCAR-T细胞在体外显示出有效的NB细胞杀伤活性

在小鼠模型中,抗GPC2和抗CD276 CAR-T细胞在33.3%的小鼠中适度抑制甚至消除了肿瘤,但抗CD276 CAR和BiCisCAR表现出了更好的疗效。此外,BiCisCAR-T细胞在第28天显示出比其他单个CAR更高的百分比,表明其具有长期抗肿瘤活性。

小鼠细胞中单GPC2或CD276靶向CAR或BiCisCAR治疗

最后,BiCisCAR-T细胞在转移性异质模型中表现出卓越的功效,具有更长的持久性并减少衰竭。为了模拟GPC2和CD276的异源表达,研究人员使用了稳定表达GPC2或CD276的NALM6细胞混合物,并用 BiCisCARs或单抗原靶向CARs处理它们。实验表明,在用BiCisCAR-T 细胞处理的小鼠中,无论是表达GPC2还是表达CD276的NALM6细胞均不可检测,且这些小鼠的生存期也显着延长,表明了与单靶点 CAR-T细胞相比,BiCisCAR-T细胞的抗肿瘤能力有所提高。之后,研究人员白血病细胞表达GPC2或CD276的模型中,测量了CAR-T细胞输注21天后小鼠脾脏中CAR-T细胞的比例,进一步证明了BiCisCAR 在GPC2和CD276异质表达的肿瘤模型中具有更长的持久性并且不易衰竭。在NB异质小鼠模型中与NALM6实验一致,BiCisCAR-T细胞也显着抑制了肿瘤进展。

BiCisCARs在根除异质表达GPC2或CD276的肿瘤细胞、改善T细胞持久性和减少T细胞耗竭方面表现出卓越的功效

综上所述,该文章描述了一种多模式分析来识别有效的候选CAR构建体,该构建体允许识别显示最大扩增、激活特征和抗肿瘤细胞毒性的T细胞。这种多模式方法可用于系统地筛选多个TAA的多个CAR构建体,以优化CAR开发。研究人员开发了一种针对表达GPC2或CD276的NB的强效BiCisCAR,其在体内表现出持久性、不易衰竭和更多的记忆特性,有潜力成为一种新的免疫疗法用于NB高危患者。

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排版 | Sheila 校对 | uu

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