Cell｜新型蛋白酶调节平台打造更安全有效的CAR T治疗

撰文 | 李佳 责编 | 周叶斌

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）T细胞免疫治疗法是近几年来广受关注的新型细胞治疗方法。这种疗法是将人体自身的免疫T细胞分离后，对其进行基因改造，装上能够特异性识别癌细胞表面特殊抗原的嵌合抗原受体CAR，然后将这些细胞在体外大量扩增之后再回输到病人体内，这些特殊的免疫T细胞会攻击癌细胞并将其杀死。

虽然CAR T疗法在血液瘤的治疗上显示了优异的治疗效果，但它同时也伴随着严重的副作用，包括细胞因子风暴（Cytokine Release Syndrome, CRS）和神经毒性，严重的可致命。而且CAR T疗法对于实体瘤来说效果比较有限，部分是因为实体瘤缺乏肿瘤特异性抗原，使用肿瘤组织和关键正常组织共用的抗原会增加脱靶毒性。研究人员做过很多尝试想提高CAR T对实体瘤的杀伤效果，但这些提高肿瘤杀伤的方法通常也会更加提升毒性风险。所以下一代CAR T的设计更加突出了安全性的需求。

2022年5月12日，由Louai Labanieh团队发表于Cell题为Enhanced safety and efficacy of protease-regulated CAR-T cell receptors的文章，开发了一款蛋白酶调控为基础的平台，可以用FDA批准的小分子药物调节CAR活性的SNIP CAR受体。这一款CAR T设计不仅有很强的抗肿瘤活性和T细胞干性，而且在不使用药物的时候没有活性泄露，从而和传统结构CAR T相比大幅降低了毒性副作用，显示了这种CAR T细胞对于实体瘤治疗的潜在价值。

为了设计更安全有效的CAR T，美国斯坦福大学的研究者们开发了一款高效的可药物调抗的抑制性蛋白酶信号中和（Signal neutralization by an inhibitable protease, SNIP ）的CAR T，调抗蛋白酶的小分子药物已通过FDA批准，有对人体有利的药物动力数据。而且基于这个平台设计的CAR T没有活性泄露，细胞更少耗竭，更多记忆性T细胞，对实体瘤的疗效远优于传统结构CAR。

为了做这个可调控设计，研究者们一开始做了三版（见下图）。A和B是顺式设计，蛋白酶串联在CAR分子上。A的蛋白酶剪切位点设计在了跨膜区内部，蛋白酶串联在膜内信号域和剪切位点之间；B的蛋白酶剪切位点设计在了跨膜区外部，蛋白酶串联在膜外单链可变片段和剪切位点的下方。C是反式设计，蛋白酶没有和CAR串联在一起，而是单独和一个跨膜分子一起表达，蛋白酶在膜的内侧，剪切位点仍然设计在CAR的跨膜区内侧。在没有小分子药物grazoprevir (GPV) 时，蛋白酶会在剪切位点将CAR切断，从而阻断信号传播使得CAR无法发挥功能（关闭状态，OFF state）。只有在GPV存在时，GPV和蛋白酶结合阻止了它的剪切功能，整个CAR的信号通路便联通往下传递（打开状态，ON state）。研究者用了针对靶向B7H3的这样三种设计检测他们的体外肿瘤杀伤功能，结果发现A设计虽然可调控，但没有肿瘤杀伤功能；B设计在ON状态有肿瘤杀伤能力，但效果不如传统结构的CAR T，而且在OFF状态时仍然有部分杀伤功能，证明存在活性泄露。C设计在ON状态时杀伤效果非常接近传统结构设计的CAR，但是OFF状态也存在活性泄露，很可能是因为没有剪切完全。

为了解决活性泄露问题，研究者们对反式设计的跨膜区域做了四种不同的CD8a 和 CD28组合（D），8/8，28/28，8/28，28/8，然后再重新验证功能，发现8/8组合的反式设计是最完美的，不仅在OFF状态没有活性泄露，在ON状态的肿瘤杀伤活性也和传统结构CAR T一致。而且检测到在ON状态时CAR的细胞表面表达量很高，OFF状态没有表达。细胞杀伤功能随药物用量在一定范围内递增，半最大效用浓度（EC50）小于该药物24小时人体剂量方案。而该CAR-T在激活状态时释放的IL2要远比传统结构设计的CAR T更高，预示了更有效和更安全的可能性。

不同SNIP CAR设计示意图和反式设计的优化方案，以及肿瘤杀伤效果

为了在小鼠体内证实该设计的CAR T对实体瘤的有效性和安全性，研究者给免疫缺陷NSG小鼠皮下注射了N6-B7H3细胞系和人的MED8A成神经管细胞瘤细胞，同时用SNIP B7H3 CAR-T进行治疗。N6-B7H3的结果和体外实验一致，但是MED8A组虽然ON状态有抗肿瘤活性，但是在OFF状态，比起对照组仍然显示有部分抑制肿瘤的作用，说明在OFF状态蛋白酶对CAR仍然没有完全剪切，可能和细胞表面抗原密度相关。所以研究者们对该设计做了第二次优化，设计了三种不同的剪切位点。然后发现剪切位点3的设计在小鼠体内也没有存在活性泄露。至此研究者找到了最合适的SNIP CAR设计。

抗原密度较高时存在SNIP CAR-T杀伤活力的泄露，通过优化剪切位点提高了在抗原密度较高时的剪切活性，减少了OFF状态时的活性泄露

研究者们用其他小鼠体内的实体瘤模型验证最后优化的这款SNIP CAR-T对多种实体瘤的杀伤效果。在成神经细胞瘤模型（肾小囊内注射），骨肉瘤模型（骨髓注射）以及成神经管细胞瘤模型（小脑注射）三种实体瘤模型中均可看到当SNIP CAR T用药物调节到ON状态时，对肿瘤的杀伤能力均好于传统结构型的CAR T，最后的小鼠存活率也非常惊人。

SNIP CAR-T对多种实体瘤模型有更好的肿瘤杀伤效果

研究者们进一步发现更好的肿瘤杀伤效果是和这些小鼠体内的SNIP CAR-T细胞更少耗竭，更多干细胞记忆性T细胞，和更高的反应效率有关系。通过大通量RNA测序以及表达组研究，SNIP CAR T比传统结构CAR-T细胞表达更多的干性相关分子，以及杀伤性相关因子。细胞的激活程度，细胞增殖水平，CAR在细胞表面存续时间都有显著提升。而且研究者发现这些功能上的提升是和SNIP CAR T细胞在OFF状态时的静息（resting）效应有关系。

最后研究者测试SNIP CART是否可以提供一个更安全的肿瘤杀伤作用。他们采用了以前被证实存在脱靶毒性的ROR1.BBz CAR T，证实了在回输这些细胞后，小鼠体内肺，胸腺和肾脏存在大量活化的CAR-T细胞，是致命毒性的主要原因。然后研究者将其改造成SNIP CAR T，检测是否停止用药可以逆转这些毒性反应。用传统结构CAR T治疗的小鼠在四天内就因致命毒性而死亡，而在第二天停止用药的SNIP CAR T治疗组的小鼠逆转了毒性造成的影响。

研究者们进一步考察了药物的剂量，是否可以通过调节剂量，存在一个剂量窗口可以使得SNIP CAR T细胞只攻击表达较高抗原水平的肿瘤细胞，但放过抗原表达水平较低的正常组织。他们给Nalm6-ROR1 肿瘤模型小鼠一天一次50 mg/kg GPV and 25 mg/kg ritonavir (RTV) ，RTV是GPV的促进剂。然后这些老鼠既没有体重下降，同时也维持了较好的抗肿瘤活性。作者也用其他实体瘤模型证实了这一结论。

调节药物剂量找到维持抗肿瘤特性的同时避免副作用的治疗窗口

总之， 该研究为CAR T在实体瘤治疗中的应用拓宽了方向，提供了一种高效的FDA批准药物可调控的CAR T设计平台，使得CAR T细胞在更好地发挥杀伤肿瘤细胞功能的同时提高了安全性，为将来临床应用提供了更好更有效率更安全的一种方法。但SNIP CAR T的长期体内影响和免疫原性仍需要深入研究。

在实际应用中，剂量的预测会比较困难，不同的肿瘤负荷，抗原表达量，药物PK，T细胞的潜能都会影响剂量判断，将是临床应用中的一个难点。如何通过剂量调节平衡抗肿瘤的效果和减少快速免疫反应产生的毒性也仍然需要深入的临床试验。

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