Nature深度综述：mRNA技术的开发策略与未来

mRNA技术在新冠疫苗开发方面的成功，不但在广大人群中积累了丰富的积极疗效和安全性数据，而且展示了将mRNA技术从研发推动到监管批准的道路。这一领域的创新产品开发也成为人们关注的领域。

近日，Nature Reviews Drug Discovery发表了两篇文章，一篇深度综述详细介绍了mRNA疫苗的技术基础，以及预防传染病的mRNA疫苗开发的关键因素；另一篇文章对目前的mRNA研发管线进行了盘点。

mRNA的设计和合成原理

mRNA疫苗的主要部分之一是人工合成的mRNA分子，它们指导细胞生成激发免疫反应的抗原。mRNA的结构可以分为5个部分，从5’端开始，分别是5’端帽，5’非转录区（UTR），编码抗原的开放阅读框，3’UTR和多腺嘌呤尾。每个部分对于mRNA疫苗的正常工作都至关重要。

5’端帽的作用之一是防止mRNA被细胞中识别病毒RNA的传感器发现，从而预防不必要的免疫反应。它还保护mRNA不受到核酸外切酶的降解。

3’多腺嘌呤尾的长度间接调节mRNA的转译和半衰期。它与5’端帽，以及与多腺嘌呤尾结合蛋白和转译启动蛋白一起，募集核糖体并且启动转译过程。

5’和3’UTR调节mRNA的转译、半衰期和细胞内定位。对UTR的工程化设计可以改变mRNA的细胞定位，或者降低mRNA的降解。

▲mRNA结构的5个部分（图片来源：参考资料[1]）

编码抗原的开放阅读框是最重要的一部分。这一部分的改良包括对mRNA密码子的优化，将不常用的密码子转换为编码同一氨基酸的常用密码子可以提高转译水平。例如，CureVac公司的新冠疫苗CVnCoV就使用了密码子优化。

提高转译的另一个改良措施是引入修饰过的核苷，例如假尿嘧啶，N1-甲基假尿嘧啶等核苷。由于自然mRNA都包含修饰过的核苷，因此免疫系统会将未修饰过的单链RNA识别为病毒感染的标志。人体细胞中的Toll样受体（TLR3、TLR7、TLR8）以及RIG-I受体称为模式识别受体（pattern recognition receptors），它们能够触发1型干扰素的产生，从而阻断mRNA的转译。

使用修饰过的核苷能够防止模式识别受体的识别，从而让mRNA生成足够水平的蛋白抗原，激发免疫反应。Moderna和辉瑞/BioNTech的mRNA新冠疫苗都使用了修饰过的核苷。

CureVac防止mRNA被模式识别受体发现的策略是通过序列工程化和密码子优化来消除疫苗mRNA中的尿嘧啶，同时提高GC水平。

在改良mRNA序列之外，过去几十年里，mRNA的生产工艺也得到了简化。目前临床使用的合成mRNA从质粒DNA转录而成。mRNA的多腺嘌呤尾序列已经编码到质粒DNA中，从而避免了添加多腺嘌呤尾的步骤，在降低生产时间的同时减少了材料损失。

将多腺嘌呤尾序列加入到质粒DNA中同时解决了多腺嘌呤尾合成长度不一的问题。通常，多腺嘌呤尾长度超过100个碱基对于治疗性mRNA效果最佳，然而过长的多腺嘌呤序列会导致质粒DNA的稳定性下降，不利于转录。解决这一挑战的策略包括在多腺嘌呤尾中添加一个序列为UGC的连接子。辉瑞/BioNTech的新冠疫苗BNT162b2就使用了这种连接子。

这些多方面的创新结合在一起，克服了mRNA生产方面的诸多挑战，促进了简易、有效、可扩大化的mRNA合成流程的诞生。

递送mRNA疫苗的载体

因为mRNA是一个包含负电荷的大分子，它无法穿过由阴离子脂质构成的细胞膜，而且在体内，它会被先天免疫系统的细胞吞噬，或者被核酸酶降解，因此需要创新的递送载体。目前的递送载体包括以下几种类型：

脂质纳米颗粒

脂质纳米颗粒（LNP）是目前临床进展最快的mRNA递送技术，目前所有获得授权使用的新冠mRNA疫苗均采用LNP作为载体。LNP具有多种优势，包括配方简易、具有模块性、生物相容性和mRNA载荷水平高。

通常LNP包含四种成分，可电离脂质（ionizable lipid）、胆固醇、辅助磷脂和PEG修饰的脂质分子。它们结合在一起保护脆弱的mRNA分子。

▲脂质纳米颗粒的主要脂质成分（图片来源：参考资料[1]）

可电离脂质分子可以说是LNP中最重要的成分，它们在酸性环境下携带正电荷，让它们可以与携带负电荷的mRNA结合生成LNP。在生理pH值时它们呈中性，这提高了它们的安全性，并且延长了它们在血液循环中的驻留时间。在被细胞吞噬进入内体后，内体的酸性环境会让它们重新携带正电荷，从而促进与内体细胞膜的融合，将mRNA释放到细胞质中。

胆固醇提高纳米颗粒的稳定性，并且帮助脂质体与内体细胞膜的融合。

辅助脂质分子调节纳米颗粒的流动性，并且辅助与内体的细胞膜融合。

PEG修饰的脂质成分提高LNP的稳定性，而且通过限制脂质融合调节纳米颗粒的大小，并通过降低与巨噬细胞的非特异性相互作用来提高纳米颗粒的半衰期。

复合物和聚合物纳米粒子

虽然临床进展不如LNP迅速，但是聚合物与脂质具有类似的优点，也能够有效递送mRNA。阳离子聚合物可以与mRNA形成不同大小的复合体。目前已经有多种可以被生物降解的聚合物材料用于有效递送mRNA。

与可电离脂质分子类似，pH敏感的聚合物也已经被用于递送mRNA。将这些聚合物在内体的酸性pH值下会被质子化，促进RNA的释放。

▲递送mRNA的聚合物纳米颗粒（图片来源：参考资料[1]）

其它递送系统

在基于脂质和聚合物的递送方式之外，多肽也可以被用于递送mRNA，因为有些氨基酸携带阳离子或双亲性氨基基团，可以与mRNA结合。

最后，基于角鲨烯（squalene）的阳离子纳米乳液也被用于递送mRNA。这些纳米乳液由一个基于角鲨烯的核心和一个脂质外壳构成。mRNA被吸附在纳米乳液的表面。有些角鲨烯的配方可以起到佐剂的作用。例如诺华的MF59在FDA批准的流感疫苗中作为佐剂。MF59导致注射部位的细胞分泌趋化因子，募集抗原呈递细胞，促进单核细胞分化为树突状细胞，并且增强抗原呈递细胞的抗原摄取。

▲递送mRNA的阳离子纳米乳液（图片来源：参考资料[1]）

传染病mRNA疫苗的进展

在mRNA技术的临床应用方面，针对传染病的疫苗开发是进展最快的方向。综述指出，截至今年6月18日，目前进入临床开发阶段的102种新冠疫苗中，有19款为mRNA疫苗。其中，辉瑞/BioNTech和Moderna公司开发的新冠疫苗已经获得多家监管机构的紧急或暂时授权。日前，美国FDA也已经正式批准辉瑞/BioNTech开发的新冠疫苗。

在新冠病毒之外，多款mRNA疫苗也已经进入临床开发阶段，用于预防巨细胞病毒（CMV）、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒、狂犬病毒等病原体的感染。

针对不同的病原体，mRNA疫苗的开发也会遇到不同的挑战。包括病毒突变迅速（HIV病毒），高致死性（狂犬病毒），新病毒株和突变体的产生（流感病毒和新冠病毒）等等。因此mRNA疫苗的设计也需要做出相应的调整，包括靶向抗原中保守的区域，携带多种突变体或者病毒株的抗原等等。

▲针对不同病原体开发mRNA疫苗面对的挑战和应对策略（图片来源：参考资料[1]）

mRNA疫苗开发的关键问题

抗体反应的持久性

疫苗接种之后，转译生成的抗原被抗原呈递细胞摄取并且运送到淋巴结中。在那里，抗原呈递细胞、B细胞、和滤泡辅助T细胞之间的相互作用促进生发中心（germinal center）的形成。在生发中心，B细胞增殖、分化、并且产生抗体基因的突变，从而产生能够针对抗原的高亲和力中和抗体。生发中心反应和滤泡辅助T细胞的诱导对于产生长久的保护力至关重要。

为了增强这一免疫反应过程，有些mRNA递送系统主动靶向抗原呈递细胞，让它们成为生产抗原的“细胞工厂”。通过在LNP表面偶联单克隆抗体或者与树突状细胞特异性结合的配体，在主动递送mRNA进入抗原呈递细胞方面已经获得可喜的效果。

此外，延长mRNA能够转译蛋白的时间可以改变疫苗的药代动力学特征，也能起到增强抗体反应的效果。

针对新出现病毒变体的疫苗开发

病毒基因组在复制时常常会发生突变。虽然大部分突变对病毒的功能没有影响，但是有些突变可能增强免疫逃逸，限制疫苗的效力。例如，HIV病毒的迅速突变导致过去30多年的疫苗开发努力仍然没有产生有效的疫苗。流感疫苗的突变需要疫苗开发商每年针对主要的病毒株对疫苗配方进行修改。

目前，针对病毒突变的创新策略包括开发靶向病毒保守区域的疫苗，例如靶向流感病毒血凝素的“颈部”（stalk）；或者让疫苗编码广谱中和抗体。

新冠病毒新近出现的突变也让人们关注mRNA疫苗对突变体的效果。目前，多家公司已经着手开发针对突变株的增强疫苗。长远来看，开发一种能够预防新冠病毒和其它未来冠状病毒的泛冠状病毒疫苗非常重要。目前的研究已经提供了概念验证。借鉴HIV和流感病毒的经验，对新冠病毒结构的新洞见将促进发现在不同冠状病毒中保守的位点，加快抗原发现和疫苗设计。

安全性

总体来说，mRNA疫苗的安全性特征良好，在临床试验中只发现轻度或中度不良事件。

综述指出，疫苗造成的过敏反应在接种辉瑞/BioNTech新冠疫苗人群中出现的比例大约为每百万次接种中出现4.7例，Moderna疫苗这一数值为2.5例/百万次接种。这个数值是更为传统的疫苗的2-4倍。解释过敏反应的一个假说与LNP中使用的PEG修饰脂质分子相关。由于人们此前使用过很多包含PEG的日用产品（例如牙膏、洗发露等等），身体中已经存在针对PEG的抗体。这些抗体可能提高过敏反应出现的可能性，并且限制疫苗的效力。

很明显的是，mRNA疫苗开发领域需要对疫苗配方导致过敏反应的机制有更深入的了解，从而改进配方，提高安全性特征。

疫苗的可及性

疫苗的可及性是达到广泛保护目的面对的最大挑战，特别是在低收入国家。对于已经获得授权的mRNA新冠疫苗来说，可及性进一步受到冷藏条件的限制。

如果要在全球范围内对几十亿人进行接种，则需要耐热性更好的疫苗。在临床前研究中，CureVac公司证明序列优化的狂犬病毒在研疫苗RABV-G能够在-80℃到70℃之间的区域保持稳定几个月。而且，目前有报告显示，两款在研mRNA新冠疫苗能够在室温环境下保持稳定。如果这些耐热候选疫苗在临床试验中获得积极结果，有望提高mRNA疫苗的全球可及性。

展望未来

在mRNA技术在传染病疫苗领域获得突破性进展的同时，mRNA技术在其它领域的应用也正在展开。在Nature Reviews Drug Discovery上发布的一篇文章对截至今年7月，31家mRNA公司的180个管线项目进行了盘点。这一分析发现，除了主要针对传染病的预防性疫苗，多家公司也在开发治疗性疫苗（主要为癌症疫苗）和创新mRNA疗法。

▲在研mRNA疫苗和疗法研发管线一览（图片来源：参考资料[2]）

我们期待随着科学的进步和技术的发展，mRNA技术能够获得更为广泛的应用，造福广大病患！

参考资料：

[1] Chaudhary et al., (2021). mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-021-00283-5

[2] Xie et al., (2021). Evolution of the market for mRNA technology. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/d41573-021-00147-y

注：原文略有删减